① PCR 三步循环 —— 分子的「复印机」
PCR（聚合酶链式反应）的本质，是用一对引物把目标 DNA 片段在体外反复复制。每经历一个「变性→退火→延伸」的温度循环，目标 DNA 数量就翻一倍，n 个循环后放大到原来的 2ⁿ 倍 —— 30 个循环就是约 10 亿倍。这就是它能把极微量的病毒核酸「放大到能看见」的根本原因。
三步温度循环
变性：高温把双链「拉开」成单链；退火：降温让引物结合到目标位点；延伸：聚合酶顺着引物合成新链。周而复始，指数扩增。
关键点
· 变性温度不够 → 解链不彻底，扩增失败
· 退火温度是关键：太高引物不结合（假阴性），太低非特异结合（假阳性）
· 延伸时间由片段长度和酶的延伸速率决定（Taq 约 1 kb/min）
对应宝锐货号
E20/FE20 Robustart Taq QS Ⅱ M2181 FastAmpli Premix
客户自配体系买酶，图省事买预混液（酶+dNTP+缓冲液已配好）。
📚 Saiki RK et al. (1988) Science 239:487–491 — 首次用耐热 Taq 酶实现自动化 PCR，是 PCR 走向实用的里程碑；Mullis KB & Faloona FA (1987) Methods Enzymol 155:335–350 — PCR 原理奠基。
② 实时荧光定量 qPCR —— 边扩增边「数数」
普通 PCR 是「扩增完再看结果」，qPCR 则是每个循环都测一次荧光。荧光强度反映产物量，把每个循环的荧光连起来，就得到一条 S 形的扩增曲线：基线期（信号淹没在背景里）→ 指数期（每循环翻倍）→ 平台期（原料耗尽）。
扩增曲线与 Ct 值
Ct 值（循环阈值）：荧光信号首次超过阈值线时的循环数。Ct 越小 = 初始模板越多。样本里病毒越多，Ct 就越小（比如 20 vs 35）。
为什么 Ct 能定量？
因为扩增是指数的，初始模板量每差 10 倍，Ct 大约就差 3.3 个循环。用已知浓度的标准品做出「浓度—Ct」标准曲线，就能把未知样本的 Ct 换算成浓度。
对应宝锐货号
M2181-4 FastAmpli Premix-UNG Ⅳ M2071 Superstart Premix
Probe qPCR 预混液 = 探针法定量专用。
📚 Higuchi R et al. (1993) Nat Biotechnol 11:1026–1030 — 首次实现 PCR 扩增的实时荧光监测，奠定 qPCR 基础。
③ 探针法 vs 染料法 —— 两条「发光」路线
qPCR 靠什么发光？两种主流化学：TaqMan 探针法和 SYBR 染料法。这是客户最常问、也最容易分不清的点。
TaqMan 探针法
特异性最高，多重检测首选
- 探针两端带荧光基团（5'）和淬灭基团（3'），完整时不发光
- 扩增时酶用 5'→3' 外切酶活性把探针「咬断」，荧光基团和淬灭基团分离 → 发光
- 只认特定序列 → 特异性高，一管可装多个探针做多重检测
- 成本较高，需专门设计探针
SYBR 染料法
便宜通用，特异性靠熔解曲线
- 染料结合任何双链 DNA就发光，不需探针
- 便宜、通用 → 适合初筛、大量样本
- 会结合非特异产物/引物二聚体 → 特异性弱
- 靠熔解曲线（看产物 Tm 值）判断特异性
对应宝锐货号：宝锐主推 Probe qPCR 预混液（探针法），货号 M2181 FastAmpli M2071 Superstart M5244 Neoscript RT。客户做多联检（呼吸道多合一）、要求特异性，推探针法体系。
📚 Holland PM et al. (1991) PNAS 88:7276–7280 — 首次利用 Taq 酶 5'→3' 外切酶活性水解探针（TaqMan 原理）。
④ 逆转录 —— 让 RNA 也能测
很多病毒（新冠、流感、艾滋病）基因组是 RNA，而 PCR 只能扩增 DNA。所以要先逆转录：用逆转录酶把 RNA 复制成互补 DNA（cDNA），再进入 PCR。
一步法 vs 两步法
· 一步法（One-step）：逆转录 + qPCR 同一管完成，省事、污染风险低 → 宝锐 RT 预混液主形态
· 两步法（Two-step）：先单独逆转录成 cDNA，再 qPCR，更灵活、适合大量样本复用 cDNA
对应宝锐货号
E13/FE13 Neoscript RTase（逆转录酶，自配体系）
M5244 Neoscript Fast RT Premix MD2104 SensiDirect RT Premix（一步法预混液）
销售要点：客户问「你们逆转录酶耐不耐高温？」—— 高温逆转录能打开 RNA 二级结构，效率更高、假阴性更少。Neoscript RTase 耐高温是卖点。
📚 Verma IM (1977) Biochim Biophys Acta 473:1–38 — 逆转录酶经典综述。
⑤ UNG/dUTP 防污染 —— 防止「假阳性」
qPCR 最大的敌人是气溶胶污染：上一次扩增的产物飞溅到空气里，污染下一次反应，造成「样本没病毒却测出阳性」（假阳性）。防污染的成熟方案是 UNG/dUTP 体系：
1. 反应里用 dUTP 代替 dTTP，扩增产物里就带「尿嘧啶 U」标记
2. 反应前加 UNG 酶（尿嘧啶 DNA 糖基化酶），它专切含 U 的 DNA
3. 上轮残留的产物（含 U）被 UNG 降解，真正的样本（含 T，不含 U）不受影响
对应宝锐货号：宝锐预混液标配 UNG（货号名里的「-UNG」就是防污染），如 M2181 FastAmpli Premix-UNG Ⅳ；也可单独买 E01 UNG 搭配自配体系。
📚 Longo MC et al. (1990) Gene 93:125–128 — 首次提出用尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG/UNG）控制 PCR 交叉污染。
⑥ 热启动 —— 消灭「低温错配」
PCR 配液时温度低，酶可能提前工作，把错配的引物「乱扩」，产生非特异产物。解决方法是热启动（Hot Start）：常温下抑制酶活性，升温到变性温度后才激活。
两种热启动修饰
| 方式 | 原理 | 特点 |
|---|
| 抗体修饰 | 抗体堵住酶活性中心 | 激活快、无需额外步骤 |
| 化学修饰 | 化学基团修饰酶 | 更稳定、但需短时高温激活 |
对应宝锐货号：E20/FE20 Robustart Taq QS Ⅱ（热启动 Taq）、E03 HS Taq、E29 Neoscript RTase HS（热启动逆转录酶）。「QS」「HS」就是热启动的标志。
📚 Chou Q et al. (1992) Nucleic Acids Res 20:1717–1723 — 热启动 PCR 提升低拷贝扩增的经典研究。
⑦ 性能指标 —— 客户拿来「比货」的硬指标
客户对比原料时，盯的就是这几个数。能看懂、能解释，才算「懂技术」的销售。
| 指标 | 含义 | 好坏的判断 |
|---|
| 灵敏度 / LOD | 能可靠检出的最低浓度 | 越低越好，如「5 拷贝/反应」 |
| 特异性 | 只扩增目标、不碰非目标 | 熔解曲线单峰、无非特异扩增 |
| 扩增效率 | 每循环模板翻倍率 | 90–110% 为佳（理想 100%） |
| 线性范围 | Ct—浓度线性对应区间 | 越宽越实用 |
| 批间差 | 不同批次性能一致性 | 越小越好，原料厂核心竞争力 |
| 稳定性 | 储存/冻融后性能不衰减 | 冻融耐受次数、货架期 |
📚 Bustin SA et al. (2009) Clin Chem 55:611–622 — MIQE 指南，qPCR 实验设计、执行、报告的国际标准，客户质疑数据时可用它作权威依据；2025 年已更新为 MIQE 2.0。
⑧ LAMP 等温扩增 —— 不要 PCR 仪的快检
LAMP（环介导等温扩增）在恒定温度（60–65℃）下就能扩增，不需要反复升降温度，因此不需要昂贵的 PCR 仪，非常适合POCT、现场快检、基层检测。核心是 Bst DNA 聚合酶（具链置换活性）。
对应宝锐货号：PFHW1007 Lamp Premix Plus（Bst2.0/3.0 热启动）、FE103 Bst 2.0 HS（Bst 酶）。
📚 Notomi T et al. (2000) Nucleic Acids Res 28:e63 — LAMP 技术奠基论文。